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    亲和层析纯化卵白质常见问题解析

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    亲和层析主要依靠卵白质与介质配体间特异性的可逆结相助用进行疏散。配体可直接与目标卵白质结合 ,也可以与卵白质共价结合的标签结合。亲和层析通常是一种最粗放的纯化历程 ,一般在纯化工艺的前期应用 ,可将目标物质快速的从样本中捕获出来 ,基于后续应用的要求 ,可能只需要一步亲和层析即可获得纯度及格的卵白质。

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    卵白质和亲和介质不结合

    Q:

    标签未翻译或标签被包裹在结构内部


    A:

    检查质粒序列或将标签移到其他位置 ,标签移到其它位置扔被包裹在结构内部时 ,就要将标签袒露出来(如用尿素变性 ,但尿素变性性只有部分标签卵白可以和亲和填料结合如His标签卵白和金属螯合填料 ,但GST标签和GST填料就不可在亲和结合)



    Q:

    结合缓冲液不对适及层析柱没平衡好


    A:

    调解缓冲液 ,如金属螯合介质和His标签卵白结适时pH应在7.3-8.5之间 ,在如肝素亲和介质和DNA聚合酶结适时盐浓度太高影响结合 ,应控制在50mM以下。层析柱没平衡好 ,柱床体系中的情况如pH ,离子强度也会影响结合 ,层析上样前要充分的平衡层析柱。



    Q:

    结适时间不敷


    A:

    降低上样流速让卵白和介质有充分的接触时间。



    Q:

    层析介质选的不对适


    A:

    亲和介质分类 ,一类是特异性结合一种卵白 ,另一类是特异性结合一类卵白。如卵白a介质结合一种卵白 ,而肝素介质结合一类卵白。所以选择的时侯我们一定要了解其原理。



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    卵白结合在柱子未洗脱出

    Q:

    卵白和介质结协力过强


    A:

    增加洗脱强度 ,好比his卵白和镍柱结合 ,可以增加取代基咪唑的浓度。



    Q:

    卵白聚集在层析柱上


    A:

    通过调解层析历程的缓冲液增加卵白的稳定性 ,改善卵白在层析柱上的状态。聚集在层析柱上时就要对层析柱进行CIP清洗。



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    低区分率(洗脱后纯度低)

    Q:

    层析历程流速的影响


    A:

    调解层析历程的流速 ,流速影响卵白质和介质的亲和力 ,层析时要选择合适的流速。



    Q:

    柱床未充分淋洗


    A:

    上样后 ,要对柱床进行充分的淋洗 ,将未和介质结合的留在介质颗粒间隙 ,孔内的卵白洗出来 ,在洗脱。



    Q:

    卵白之间的非特性结合


    A:

    优化体系缓冲液 ,好比加入10%的甘油等减少卵白之间的非特异性结合。



    Q:

    介质的非特异性结合


    A:

    优化缓冲液 ,减少层析历程的非特异性结合 ,如His卵白用金属螯合填料纯化时 ,可以在缓冲液中加入300mM的氯化钠 ,减少卵白和介质的非特异性结合。



    Q:

    洗脱历程的影响


    A:

    如肝素柱子洗脱历程中拉合适的盐梯度可以提高特异性 ,His标签卵白和金属螯合介质结合后 ,洗脱时拉咪唑梯度可以提高纯度。



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    卵白质纯化历程中失活

    Q:

    卵白去折叠或聚集


    A:

    优化缓冲液使其利于卵白质坚持稳定。卵白质在介质上的高密度下容易聚集可以添加一些卵白的增溶剂等。



    Q:

    纯化历程中坚持卵白的活性的辅助因子被去除


    A:

    如一些酶类的活性需要金属离子辅助其活性 ,在纯化历程中就要添加卵白的活性辅助因子。



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