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上一期小赛给各人分享了一篇KingFisher纯化细胞的文章，获得了许多小同伴的关注，这次小赛又给您带来了一篇KingFisher做卵白纯化的文章，KingFisher仪器不但能用于新冠病毒的检测，还能用于新冠药物靶点的研究。
2020年5月，一篇名为 “A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing” 的重磅论文在Nature上宣布，推动治疗新冠药物的研发进程。论文通过揭示SARS-CoV-2病毒与人类卵白相互作用（protein–protein interaction, PPI）的图谱来揭示病毒如何劫持细胞系统，找到了332个SARS-CoV-2卵白与人类卵白质之间的相互作用关系，并鉴定出69种能靶向滋扰的化合物。这项研究无论关于“老药新用”治疗新冠疾病，照旧关于指明新药的研发偏向，都有重要的意义。
值得一提的是
科学家在研究中使用了全自动纯化系统KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific) 和质谱剖析仪Q Exactive Orbitrap Mass Spectrometers (Thermo Fisher Scientific) 来实现亲和纯化质谱（affinity purification mass spectrometry，AP-MS），找到了药物靶点，为新冠药物开发助力。
研究要领
他们首先单独研究了 29 种 SARS-CoV-2 卵白中的 26 种（表1）。
表1. SARS-CoV-2卵白表，包括分子质量、与SARS-CoV同源物的序列相似性以及基于SARS-CoV同源物的推断功效。
如何找到这26种病毒卵白会与人体里的哪些卵鹤爆发相互作用呢？
研究人员利用在 HEK293T/17 细胞中表达的病毒卵白进行亲和纯化质谱（AP-MS）。SARS-CoV-2 病毒卵白经过密码子优化并克隆到带有亲和标签（或诱饵）的哺乳动物表达载体中。在宿主细胞中表达这些病毒卵白后，通过高通量的纯化系统KingFisher Flex，在与宿主卵白相互作用的配景下纯化病毒卵白并通过多次纯化洗涤，尽量制止杂卵白的滋扰。结合质谱剖析获得的数据，生成SARS-CoV-2卵白和人类卵白之间的 PPI 图谱（图1）。
图1. AP-MS鉴定SARS-CoV-2宿主卵白-卵白质相互作用的实验流程。
凭据这些卵白相互作用的数据，科学家们在已经批准的药物、正在临床试验的药物、以及尚未进入临床试验的化合物中，寻找能够选择性滋扰病毒卵白-人类卵白相互作用的分子。
为了进一步证明药物的抗病毒性，研究团队与两个正在实验室中处理 SARS-CoV-2 病毒的研究小组相助，在 Vero 细胞培养病毒检测中测试病毒。
主要发明1
绘制SARS-CoV-2病毒卵白与人体卵白相互作用网络
研究团队首次系统剖析了SARS-CoV-2在熏染历程中可能与哪些人类卵白质相互作用。用亲和纯化质谱法（AP-MS）对27个标记的病毒卵白（26种新冠病毒卵白和1种突变体卵白）进行剖析，基于卵白质之间的相互作用，确定新冠卵白与人类卵白质的作用关系，并鉴定了332种高置信度新冠卵白-人类卵白相互作用网络（图2）。
图2. SARS-CoV-2卵白-卵白相互作用网络。26种SARS-CoV-2卵白(红色菱形)与人类卵白(圆形;药物靶点:橙色;卵白复合物:黄色;同一生物历程中的卵白质:蓝色)之间332种具有高置信度的相互作用。
为了进一步验证互作卵白，研究团队研究了人类相互作用卵白的生物学功效、解剖表达模式、SARS-CoV-2熏染期间的表达变革以及与宿主-病原体相互作用卵白的其他图谱�？蒲Ъ曳⒚髡庑┬鹿诓《韭寻准尤牖虻骺亍⑿藕抛肌⒂し从Φ榷喔鲆ο赴�。约40%卵白互作卵白与内室或者囊泡运输途径有关。其中新冠病毒会对多条先天免疫系统通路如滋扰素通路和 NF-κB通路等爆发负面影响。别的，两个调理抗病毒先天免疫信号通路的人类卵白，也会被新冠病毒卵白所靶向和针对。
主要发明2
筛选干预卵白相互作用网络的现有药物
通过研究卵白互作，科学家找到了这些潜在的药物靶点。通过整理这些会与新冠卵白相互作用的卵白信息，科学家们比照FDA的数据，在已经批准的药物、正在临床试验的药物、以及尚未进入临床试验的化合物中，找到了69个能够选择性滋扰新冠卵白与人类卵白相互作用的化合物（图3）。在这69种化合物中，27种为已经通过FDA批准上市的药物，另外另有14种药物目前还处于临床研究阶段，剩余28种还未进入临床研究。
图3. 药物和人类靶点的网络。图中显示了SARS-CoV-2毒饵与已批准药物(绿色)、临床候选药物(橙色)和临床前候选药物(紫色)的卵白-卵白相互作用，以及针对宿主卵白(白色配景)或已知宿主因子(灰色配景)的实验运动。
是否这69种化合物都具有抗病毒活性呢？为了在体外测试这些药物，他们在纽约和巴黎做了病毒熏染性实验（图4）。在纽约西奈山医院，他们开发了一种中通量免疫荧光技术剖析(检测病毒NP卵白)筛选37种化合物，研究Vero E6细胞系SARS-CoV-2熏染的抑制作用 ；在法国的巴斯德研究所，另一批科学家通过PCR (RT-qPCR)检测44种药物和化合物。这两个实验发明了两类分子能减少病毒的熏染性：mRNA 翻译抑制剂和 Sigma1 和 Sigma2 受体的预测调理因子。后续研究标明，这些分子作用于病毒入侵细胞之前，可以起到阻断病毒熏染的作用。
图4. 病毒熏染性试验示意图。
为了理解这些抑制剂发挥抗病毒作用的机制，科学家进行了时间历程实验，在熏染前或熏染后差别时间添加药物。结果显示（图5）PB28、佐他替芬 (Zotatifin) 和羟基氯喹均降低了病毒的检出，别的，这三种分子在病毒侵入后的熏染后4小时内均能抑制NP的表达。因此，这些分子似乎在病毒复制历程中发挥其抗病毒作用。
图5. 熏染前后添加药物的抗病毒作用区别。在添加高滴度病毒(MOI = 2)之前或之后添加药物，抗病毒效果相似。
在本研究中，KingFisher Flex资助研究人员解决了以下问题：
1. 纯化的均一性。96通量卵白样本在亲和纯化时在同一条件下完成，实验更严谨。
2. 提高实验效率。AP-MS实验涉及大宗的标签卵白纯化，全自动纯化系统KingFisher Flex取代手工操作，节约时间，可重复性强。
3. 实验准确性。多档速度可调搭配高吸附磁珠，实验历程中，尽可能多的标签卵白被纯化出来，提高药物靶点研究的准确性。
参考文献
David E. Gordon, Gwendolyn M. Jang, et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature 2020, 583, 459–468
