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为何要检测内毒素 图片
为内毒素无处不在
内毒素又称为脂多糖（lipopolysaccharides ，LPS ，分子量规模为3,000至4,000Da ，由长链复合多糖尾部和疏水脂质基团组成（图1）） ，是大大都格兰氏阴性菌细胞壁的组成部分 ，具有较高的热稳定性 。当细菌在活跃生长或在死亡剖析时 ，细胞壁中的脂多糖就被释放到周围情况中 。
图1.脂多糖结构 。内毒素为复合脂多糖 ，是革兰氏阴性细菌细胞壁的活性结构身分 。它们由焦点寡糖链、O-特异性多糖侧链（O-抗原）和脂质组分（脂质A）组成 。
使用如大肠杆菌(E.coli)生产的重组卵白 ，或者提取革兰氏阴性菌内的核酸时经常遇到内毒素污染问题 。内毒素污染的卵白质/抗体/核酸在转染入细胞中或者注入到动物体内时 ，可引发强烈的免疫反应 ，导致全身性炎症反应综合征（SIRS）和/或败血症 。因此 ，内毒素的去除关于人类疾病治疗的注射型药品、生物制品等都是必须的 ，尤其关于基因药物、卵白药物、抗体药物、疫苗等生物制品的下游纯化处理来说就显得很是重要 。
中国药典的划定
细菌内毒素检查法（通则 1143）包括两种要领：凝胶法和光度测定法 ，后者又包括浊度法和显色法 ，可以选用其中任何一种要领进行细菌内毒素检查 。凝胶法和光度法各具优点和局限：
凝胶法
凝胶法的优点是操作简便 ，供试品在排除滋扰作用后均可使用凝胶法进行检验 。
凝胶法的滋扰试验是确定供试品能否使用凝胶法的决定因素 。进行滋扰实验时 ，应挑选与鲎试剂反应呈阴性的样品进行滋扰试验 。若样品稀释到 MVD(有效稀释倍数) 仍不可排除滋扰作用 ，应进一步对供试品的前处理进行研究 ，再用滋扰试验验证能否使用凝胶法 。
光度法
光度法（包括浊度法和显色法）可定量检测内毒素的含量 ，能较为准确评估产品在生产历程中污染的相对危害 ，定量检测的数据不但有利于追踪产品质量趋势 ，还能起到危害预警的作用 ，更易抵达数据完整性的要求 。
由于光度法的检测限规模比凝胶法宽 ，使得有滋扰的样品可以有更大的稀释倍数 ，关于部分使用凝胶法无法排除滋扰的样品 ，可以实验使用光度法建立细菌内毒素检测要领 。
常用实验要领和滋扰剖析
鲎试剂是从海洋动物鲎提取的血细胞溶解物,是检测革兰氏阴性细菌内毒素的一种敏感试剂 。其实验原理如图2所示：
图2.鲎试剂的级联反应 。LPS（内毒素）激活质膜结合因子C � ；罨囊蜃覥激活因子B ，活化的因子B激活凝固酶原 ，生成凝血酶 。加入显色底物Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA后 ，活化的卵白酶-凝血酶催化对硝基苯胺（pNA）的释放 ，爆发黄色 。通过丈量405nm处吸光度值进行定量 。凭据标准曲线可推算得出结果 。红色体现无活性酶 ，绿色体现活性酶 。
通常实验流程：
Thermo提供光度法内毒素定量试剂 (A39552） 。那么试剂的品质如何？我们将从灵敏度、数据重复性、抗滋扰性等几个角度对Pierce内毒素定量试剂盒的性能进行验证：
数据灵敏度和重复性
提供两个线性动态规模：0.01-0.1 EU/mL和0.1-1.0 EU/mL（图3） 。使用此试剂盒的实验-实验和操作者-操作者差别系数（CV）为3% 。灵敏度高可以有效地制止内毒素定量中潜在的假阴性或者假阳性 。
图3.Pierce内毒素定量试剂盒的标准曲线 。标准曲线显示出优异的线性度 ，r2= 0.99 。Pierce显色法内毒素定量试剂盒的较低标准曲线规模为0.01-0.1 EU/mL 。0.1–1.0 EU/mL标准曲线体现使用内毒素标准品和阿米巴样细胞裂解物培养14分钟 ，随后使用显色底物培养6分钟 。关于较低浓度 ，使用内毒素标准品和阿米巴样细胞裂解物培养30分钟 ，随后使用显色底物培养6分钟 。低浓度标准品（0.01-0.1 EU/mL）显示出了一致性和再现性（n = 17 ；CV = 3%） 。
兼容性
鲎试剂可能受许多因素影响 ，造成假阴性或假阳性 。包括：
i. 反应温度、样品酸碱度、离子强度和金属离子（如镁和钙）
ii. 血清卵白、核酸、脂肪酸、外貌活性剂和螯合剂（如EDTA和肝素）可引起内毒素分子结构的变革
iii. (1-3)-β-D-葡聚糖的非特异性滋扰：鲎试剂会与其反应 ，造成假阳性结果
表1.使用Pierce显色法内毒素定量试剂盒 ，获得有效内毒素检测结果所兼容的高浓度 。所列出的浓度是指样品中添加0.5 EU内毒素时 ，未使定量值降低的实际浓度 。以比例的形式体现稀释浓度 ，其中1:100体现100倍稀释
需要指出的是：Pierce显色法内毒素定量试剂盒（货号A39552）与β-葡聚糖兼容 ，并且在含有10ng/ mL（1,3）-β-D-葡聚糖的样品中 ，未显示出增强作用 。
内毒素去除
超滤、多粘菌素B亲和树脂以及基于树脂或膜的色谱法是内毒素去除的古板要领 ，这些要领在卵白接纳率、内毒素结合能力等方面具有局限性 ，有的甚至自己具有毒 。
Thermo Fisher Scientific提供高载量内毒素去除树脂(88270) ，是基于ε-聚赖氨酸亲和树脂（天然赖氨酸的聚合物） ，显示出内毒素结合能力和卵白质接纳率：
? 结协力可以抵达2,000,000 EU/mL
? 在处理初始内毒素水平为10,000 EU/mL的样品时 ，去除效率可以抵达99%以上
图4.接纳Pierce高通量内毒素去除树脂去除内毒素的效率 。（A）内毒素去除和定量的事情流程 。（B）测定和去除卵白质样品中的内毒素以备下游应用 。
