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    师姐喊你抄作业 | 特殊探秘qPCR 3大疑难问题!

    来源:赛默飞电子商务平台

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    01

    目标模板浓度太低


    在qPCR 中体现为CT值偏大 ,复孔重复性不佳。





    可能的原因1


    基因表达品貌低

    优化建议:选择高灵敏度、荧光信号强、更宽动态规模的qPCR试剂搪塞低品貌模板;



    可能的原因2


    模板稀释太过

    优化建议:提高模板浓度(浓缩) ,减少模板稀释度(理论上每稀释10倍 ,CT 值大 3.3);



    可能的原因3


    模板有降解

    优化建议:重新制备模板 ,注意选择好的RNA纯化Kit ,制止RNA降解 ,优化逆转录条件。


    02

    扩增效率异常

    扩增效率偏离100%±10% 应考虑优化。Ct值泛起太晚的潜在原因之一是扩增效率低 ,导致效率低的原因可能有




    可能的原因1


    反应条件未优化

    优化建议:可以在同一实验中预设差别退火温度 ,选择Ct值较小且平台期荧光强度高的那个温度;



    可能的原因2


    保存PCR反应抑制剂

    优化建议:一般反应抑制剂多为模板带入 ,可考虑重新制备模板或者稀释模板从而降低抑制剂水平;选择反应性能强健、更耐受抑制剂 的试剂有助于减少此类因素影响;



    可能的原因3


    模板扩增区域有庞大二级结构 ,高GC含量 ,影响扩增效率

    优化建议:同一目标设计多个扩增区域/避开二级结构庞大的区域;选择性能强健耐受性高的预混液 ,都是可行的解决要领。


    03

    PCR产品过长影响扩增效率




    优化建议:


    缩短PCR产品长度 ,控制在100 bp-150 bp之内



    优化建议:


    实验标准的三步扩增提高扩增效率



    优化建议:


    加长延伸时间使得反应完全 ,以提高扩增产量


    04

    无Ct值




    可能的原因1


    循环数不敷

    优化建议:一般反应设置为40个 ,须要时可增加到45个循环;



    可能的原因2


    信号收罗设置不当

    优化建议:两步扩增一般将信号收罗设置在退火延伸阶段 ,三步扩增程序应当将信号收罗设置在72℃延伸阶段。探针法通常在退火结束时或延伸结束时收罗信号。




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    01

    样本重复性差






    优化建议:


    取材部位/处理方法/时间应严谨地包管一致;选择稳定可靠的试剂盒进行样本制备(如RNA纯化尽量选离心柱 ,带去除gDNA的)、提取后对RNA的完整度和纯度进行检验 ,减少样实质量重复性差。


    02

    技术重复性差

    分为复孔重复性差(复孔之间ΔCt<0.5就算重复性良好) ,差别次跑的板间重复性差。


    排查偏向有以下——

    1

    模板浓度低容易泛起复孔重复性差 ,若同时Ct值偏大 ,可实验提高模板量。条件允许的话 ,增加复孔数 ,弃掉偏差大的值也好步伐。

    2

    加样误差是同时影响孔间和板间重复性的常见原因。良好的操作习惯有助于提高实验重复性 ,包括:按期校准加样器能减少差别时期之间的加样体积偏差;选择预混液能减少加样误差影响孔间重复性;低吸附耗材能减少试剂挂壁;稳定的操作情况温度 ,反应前充分混匀样品和试剂和离心除气泡制止影响读数 ,都有助于减少孔间差别和板间差别。注意仪器上差别位置的孔温度一致性也可能影响孔间一致性。

    3

    试剂的配液稳定性也值得重视。有时候 ,配置好的反应板纷歧定能马上上机 ,期待时长难以确定 ,导致板间误差过大——若预混液能坚持足够长时间的稳定性 ,可确定第一个检测板的结果与一个检测板的结果相匹配 ,同时还能提高事情流程的整体便当性。

    4

    试剂的批间一致性是影响重复性、实验前后可比较性的重要因素。定量PCR反应体积很小且灵敏度高 ,差别批次试剂的痕量偏差都可能影响结果稳定。尽量选择同一批次/批号的试剂 ,选择信誉可靠、批间一致性高的产品 ,有助于提高实验重复性和结果可比较性。


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    用SYBR Green可以通过测熔解曲线来剖析确认反应产品特异性 ,熔解曲线是随温度升高DNA双螺旋结构解开水平的曲线:单尖峰提示产品只有一种;多峰则提示有不止一个产品 ,好比引物二聚体或者非特异扩增。



    排查偏向有以下——




    02

    非特异扩增






    排查特征:


    电泳检测;杂峰Tm值在80℃之后 ,目标峰之后的多为非特异扩增;



    优化建议:


    引物设计特异性欠好或者模板质量不佳(如含有基因组污染)都可能导致非特异扩增


    ——建议考虑重新设计引物或者重新制备模板(记得在RNA纯化中用DNase处理降解gDNA)


    另外 ,非特异扩增也可能来自反应退火开始前种种非特异延伸 ,和“实验室某个角落or空气中的前任、前前任qPCR” DNA污染!带有UDG和dUTP配方设计的预混液可一步消除掉这类非特异产品;再加上抗体暂时关闭酶活的热启动设计 ,既能避免退火前的非特异反应 ,又能在退火同时迅速释放酶活 ,让反应更快速高效率。


    Tips:


    1

    熔解曲线不睬想还可实验两步法 ,因为二步法扩增特异性高。

    2

    单峰Tm值在80℃之前考虑没有模板的可能性

    3

    单峰不尖要考虑可能有巨细接近的非特异扩增

    4

    Mg2+离子浓度凌驾3mM以上则易形成引物二聚体 ,选择一管全包条件已优化的预混液就不必考虑


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    A

    兼顾高灵敏度和高特异性:

    包管检测的特异性同时具有更小的Ct 值 ,低检出限5拷贝

    B

    高强度荧光信号:

    更大的扩增曲线dRn值 ,更高的平台期荧光信号

    C

    宽动态规模

    可在跨6个对数级动态规模内进行精准检测 ,并确定可靠的线性

    D


    桌面稳定性高:

    配置好的qPCR反应体系可以在室温下稳定生存72小时

    E

    批间一致性高:

    生产历程遵循ISO 9001质量治理体系 ,包管数据的稳定性和重复性

    F

    抗残留污染:

    接纳UDG和dUTP配方 ,杜绝残留扩增产品污染造成的假阳性结果


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